武汉地区献血员血清TTV等几种肝炎相关病毒的基因检测
作者：李方和 杨燕 喻植群 朱凡 汪由坤 张俊 赵西平 杨东亮
单位：(同济医科大学附属同济医院临床免疫研究室，武汉 430030)
关键词：输血；肝炎；TTV DNA
咸宁医学院学报000208 摘 要 目的：了解武汉地区不同献血员血清TTV感染特点及其与其它几种肝炎相关病毒感染之间的关系。方法：采用PCR及巢式PCR对54例武汉市城区义务献血员及74例既往乡村献血者分别进行血清TTV DNA、HCV RNA及HGV RNA等检测。结果：TTV DNA、HCV RNA及HGV RNA指标阳性率在既往乡村个体献血员为43.2%、23.0%与2.7%，城区义务献血员为5.6%、1.9%与1.9%，前者TTV DNA与HCV RNA检出率较后者显著升高(P<0.01)，两组TTV DNA的检出率显著高于其他肝炎相关病毒。结论：武汉地区献血员人群存在TTV感染，长期的既往献血过程可使职业献血员TTV与HCV感染率升高；由此造成的TTV在部分乡村特殊人群中的流行已经成为武汉地区一个值得关注的流行病学问题。
, 百拇医药
中图分类号 R512.6 文献标识码 A
文章编号 1008-0635(2000)02-0100-03
Detection of TTV DNA and Other Hepatitis Virus in
Sera of Blood Donors in WUHAN Area
LI Fanghe YANG Yan YU Zhiqun et al
(Clinic Immunology Research Unit,Tongji Hospital,Tongji Medical Uniwersity,Wuhan 430030)
ABSTRACT Objective To investigate the infective characteristics of TTV and the relationship between it and otter hepatitis-associate viruses infection in sera of blood donors in Wuhan area.Methods PCR or RT nested PCR were adopted to detection TTV DNA,HCV RNA and HGV RNA in sera of 54 volunteers and 74 professional blood donors.Results The detection rate of TTV DNA,HCV RNA and HGV RNA were 43.2%,23.0% and 2.7% in professional group and 5.6%,1.9% and 1.9% in voluntteer;the positive rate of TTV DNA and HCV RNA in the former group were obviously higher than in latter(P<0.01).And in two groups,the detectioc rate of TTV DNA was significantly higher than the other hepatitis viruses.Conclusion In professional blood donors there is a high risk for TTV tansmission.
, 百拇医药
KEY WORDS Blood transfusion；Hepatitis；TTV DNA
采用PCR技术对一组武汉地区现行与既住献血员进行血清TTV DNA与其他几种新近发现肝炎相关病毒的检测，并对三者在不同献血员中的表达状况及其相互之间的关系进行了比较，现报道如下。
1 材料及方法
1.1标本
武汉地区献血员血清128份，包括市郊乡村既往个体职业献血员(均多次献血)血清74份，市区内义务献血员(均无献血史)血清54份，分别于1997年4月(乡村既往个体就血员)与1998年10月(武汉市区义务献血员)采集，分离血清，置-70℃冻存至检测。全部受检者献血体检均合格。血清抗-HCV及HBsAg阴性，ALT测值在正常水平。
1.2 试剂
, 百拇医药
血清TTV DNA PCR检测引物由本室根据Okamoto等报道的序列进行设计，扩增产物长度为122bp。上海生工公司合成[2，3]，扩增产物长度为1226p。引物系列为外引物：
T1：TATGTTACACACTCAGACG-3′
T2：GAGCCGAACGGATATTGC-3′
内引物：
T3：GCCACACACTCAGACGATAC-3′
T4：TGAGGCTGTCCAGTAGTTCA-3′，HCV RNA 及HGV RNA PCR检测的引物亦为临床免疫研究室提供。
AMV 逆转录酶、RNasin、dNTPs及Taq DNA合成酶等自Promega公司购得。
, 百拇医药
1.3 实验方法
1.3.1 核酸提取
取血清50ul，以异硫氢酸胍-糖原液列解病毒，酚和氯仿加异戊醇(100∶49∶1)抽提，异丙醇沉淀，乙醇(75%)洗涤，凉干后溶解于50ul经DEPC处理后的蒸馏水中，-30℃冻存。
1.3.2 TTV DNA检测
PCR参见以往报道[1～3]，主要步骤为：模板提取；加入反应体系(引物各0.2umol，Taq DNA聚合酶1u)；PCR扩增(94℃/30sec,57℃/30sec,72℃/30sec，共35循环)；产物的电泳与鉴定等。
1.3.3 HCV RNA与HGV RNA检测
根据以往报道[1～3]。
, 百拇医药
2 结 果
2.1几种肝炎相关病毒基因检测结果
采用PCR技术对128份血清标本进行了TTV DNA、HCV RNA和HGV RNA三种肝炎相关病毒基因物质的检测，实验结果见表1。
表1 武汉地区献血员血清三种肝炎病毒基因检测结果 检测项目
检测例数
义务献血员
个体职业献血员
例数
阳性数
%
例数
, 百拇医药
阳性数
%
TTV
128
54
3
5.56
74
32
43.24*
HCV
128
54
, 百拇医药
1
1.85
74
17
22.97*
HGV
128
54
1
1.85
74
2
2.70
, 百拇医药
与义务献血员组比较*P<0.01
2.2 三种肝炎病毒基因物质检测结果间的关系
对TTV感染与HCV和HGV两种肝炎相关病毒感染的关系进行分析，结果见表2。HCV RNA阳性者TTV DNA检测阳性率为77.8%(14/18)，显著高于HCV RNA检测阴性者(4.0%，4/100，P<0.001)；HGV RNA检测阳性与阴性者中TTV DNA检出率分别为0%(0/3)与43.3%(35/80)，HGV RNA阳性者TTV DNA检出率较阴性者高，两者有显著性差别(P<0.05)。表2 TTV感染与其他两种肝炎相关病毒感染的关系
HCV
HGV
+
-
, 百拇医药
+
-
TTV
+
14
21
0
35
-
4
79
3
80
2.3 重复感染状况
, http://www.100md.com
对个体献血与义务献血组TTV、HCV和HGV肝炎病毒重复感染的状况做进一步分析，结果见表3。表3 献血员人群TTV、HCV和HGV混合感染状况 组 别
例数
未感染
单一感染(%)
重叠感染(%)
职业献血
74
38
20(27.03)
16(21.62)
义务献血
, 百拇医药
54
49
5(8.33)
0(0.00)
3 讨 论
TTV是自甲、乙、丙、丁、戊及庚型肝炎病毒之后，日本学者Nishazawa新近发现的又一种肝炎相关病毒。献血员人群阳性率为12%，血友病患者检出率为46%，各型非甲—非戊肝病患者中的感染率在39%～52.5%之间[2～4]。国内最新研究显示密切的生活接触是其传播的另一重要因素[4]。一系列研究曾显示职业献血员及其该人群高度集聚地区HCV的感染率较正常人群显著为高[5]，但TTV感染状况的调查迄今尚未见报道。本研究对武汉地区一组既往职业献血员血清作TTV DNA检测，并与无献血史的义务献血员进行比较。两者分别为43.2%及5.6%，职业献血员高度集聚地区既往献血者的检测阳性率显著地高于自愿献血者人群。对上述人群同时做血清HCV RNA与HGV RNA检测，前者较义务献血组显著升高，推测系HCV主要经血液传播所致，后者阳性率较低，两组间未见显著差别。本组资料还显示血清TTV DNA阳性者HCV RNA检出阳性率高达77.8%，显著高于TTV阴性组的4.0%，病毒重叠感染者例数前者亦高于后者。结合本地区献血工作既往状况，以及作者早期对该地区献血员HBV及HCV感染的调查结果分析，我们有理由推测这一现象与管理不善的个体有偿献血有关。因而证实加大输血工作管理力度，推广以义务献血取代有偿献血的政策，对我国控制输血相关性疾病的传播是非常必要的。然而，尽管我国多数地区(包括武汉地区)有偿献血己经取消，但并不意味着由此造成的特定人群中TTV与HCV的区域性流行已经停止。在乡村不良卫生状况下TTV(同时包括HCV)将会通过密切的生活接触进一步传播，并可能在一定范围内造成流行。这一现象应该引起卫生管理部门的高度重视。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Nishizawa T.Okamoto H,Knishi K,et al.A novel DNA wnus(TTV)associated with elevated transfuminance levels in post-transfusion hepatitis of unknow etioiogy.Biochem Biophys Res Commun,1997；241：92
2，Okamoto H,Nishizawa T,Kato N,et al.Mclecular cloning and characterization of a novel DNA virus(TTV) associated with post-transfusion hepatitis of unknown euology.Hepatology research,1998，10：1
3，周伯平，马为民，孙彤，等.TTV在非甲-庚型肝炎患者中的检测、克隆及测序.中华传染病学杂志，1998；16：131
4，谭复明，骆抗先，王志明，等.输血后乙型和丙型肝炎毒性感染的前瞻性调查.中华肝脏病杂志，1997；5：42
5，李方和，黄元成，唐振亚，等.丙型肝炎病毒在供、受血者间传播的调查.同济医科大学学报，1997，16(3)：18
收稿1999-11-09
, 百拇医药
单位：(同济医科大学附属同济医院临床免疫研究室，武汉 430030)
关键词：输血；肝炎；TTV DNA
咸宁医学院学报000208 摘 要 目的：了解武汉地区不同献血员血清TTV感染特点及其与其它几种肝炎相关病毒感染之间的关系。方法：采用PCR及巢式PCR对54例武汉市城区义务献血员及74例既往乡村献血者分别进行血清TTV DNA、HCV RNA及HGV RNA等检测。结果：TTV DNA、HCV RNA及HGV RNA指标阳性率在既往乡村个体献血员为43.2%、23.0%与2.7%，城区义务献血员为5.6%、1.9%与1.9%，前者TTV DNA与HCV RNA检出率较后者显著升高(P<0.01)，两组TTV DNA的检出率显著高于其他肝炎相关病毒。结论：武汉地区献血员人群存在TTV感染，长期的既往献血过程可使职业献血员TTV与HCV感染率升高；由此造成的TTV在部分乡村特殊人群中的流行已经成为武汉地区一个值得关注的流行病学问题。
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中图分类号 R512.6 文献标识码 A
文章编号 1008-0635(2000)02-0100-03
Detection of TTV DNA and Other Hepatitis Virus in
Sera of Blood Donors in WUHAN Area
LI Fanghe YANG Yan YU Zhiqun et al
(Clinic Immunology Research Unit,Tongji Hospital,Tongji Medical Uniwersity,Wuhan 430030)
ABSTRACT Objective To investigate the infective characteristics of TTV and the relationship between it and otter hepatitis-associate viruses infection in sera of blood donors in Wuhan area.Methods PCR or RT nested PCR were adopted to detection TTV DNA,HCV RNA and HGV RNA in sera of 54 volunteers and 74 professional blood donors.Results The detection rate of TTV DNA,HCV RNA and HGV RNA were 43.2%,23.0% and 2.7% in professional group and 5.6%,1.9% and 1.9% in voluntteer;the positive rate of TTV DNA and HCV RNA in the former group were obviously higher than in latter(P<0.01).And in two groups,the detectioc rate of TTV DNA was significantly higher than the other hepatitis viruses.Conclusion In professional blood donors there is a high risk for TTV tansmission.
, 百拇医药
KEY WORDS Blood transfusion；Hepatitis；TTV DNA
采用PCR技术对一组武汉地区现行与既住献血员进行血清TTV DNA与其他几种新近发现肝炎相关病毒的检测，并对三者在不同献血员中的表达状况及其相互之间的关系进行了比较，现报道如下。
1 材料及方法
1.1标本
武汉地区献血员血清128份，包括市郊乡村既往个体职业献血员(均多次献血)血清74份，市区内义务献血员(均无献血史)血清54份，分别于1997年4月(乡村既往个体就血员)与1998年10月(武汉市区义务献血员)采集，分离血清，置-70℃冻存至检测。全部受检者献血体检均合格。血清抗-HCV及HBsAg阴性，ALT测值在正常水平。
1.2 试剂
, 百拇医药
血清TTV DNA PCR检测引物由本室根据Okamoto等报道的序列进行设计，扩增产物长度为122bp。上海生工公司合成[2，3]，扩增产物长度为1226p。引物系列为外引物：
T1：TATGTTACACACTCAGACG-3′
T2：GAGCCGAACGGATATTGC-3′
内引物：
T3：GCCACACACTCAGACGATAC-3′
T4：TGAGGCTGTCCAGTAGTTCA-3′，HCV RNA 及HGV RNA PCR检测的引物亦为临床免疫研究室提供。
AMV 逆转录酶、RNasin、dNTPs及Taq DNA合成酶等自Promega公司购得。
, 百拇医药
1.3 实验方法
1.3.1 核酸提取
取血清50ul，以异硫氢酸胍-糖原液列解病毒，酚和氯仿加异戊醇(100∶49∶1)抽提，异丙醇沉淀，乙醇(75%)洗涤，凉干后溶解于50ul经DEPC处理后的蒸馏水中，-30℃冻存。
1.3.2 TTV DNA检测
PCR参见以往报道[1～3]，主要步骤为：模板提取；加入反应体系(引物各0.2umol，Taq DNA聚合酶1u)；PCR扩增(94℃/30sec,57℃/30sec,72℃/30sec，共35循环)；产物的电泳与鉴定等。
1.3.3 HCV RNA与HGV RNA检测
根据以往报道[1～3]。
, 百拇医药
2 结 果
2.1几种肝炎相关病毒基因检测结果
采用PCR技术对128份血清标本进行了TTV DNA、HCV RNA和HGV RNA三种肝炎相关病毒基因物质的检测，实验结果见表1。
表1 武汉地区献血员血清三种肝炎病毒基因检测结果 检测项目
检测例数
义务献血员
个体职业献血员
例数
阳性数
%
例数
, 百拇医药
阳性数
%
TTV
128
54
3
5.56
74
32
43.24*
HCV
128
54
, 百拇医药
1
1.85
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HGV
128
54
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2.70
, 百拇医药
与义务献血员组比较*P<0.01
2.2 三种肝炎病毒基因物质检测结果间的关系
对TTV感染与HCV和HGV两种肝炎相关病毒感染的关系进行分析，结果见表2。HCV RNA阳性者TTV DNA检测阳性率为77.8%(14/18)，显著高于HCV RNA检测阴性者(4.0%，4/100，P<0.001)；HGV RNA检测阳性与阴性者中TTV DNA检出率分别为0%(0/3)与43.3%(35/80)，HGV RNA阳性者TTV DNA检出率较阴性者高，两者有显著性差别(P<0.05)。表2 TTV感染与其他两种肝炎相关病毒感染的关系
HCV
HGV
+
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TTV
+
14
21
0
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79
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2.3 重复感染状况
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对个体献血与义务献血组TTV、HCV和HGV肝炎病毒重复感染的状况做进一步分析，结果见表3。表3 献血员人群TTV、HCV和HGV混合感染状况 组 别
例数
未感染
单一感染(%)
重叠感染(%)
职业献血
74
38
20(27.03)
16(21.62)
义务献血
, 百拇医药
54
49
5(8.33)
0(0.00)
3 讨 论
TTV是自甲、乙、丙、丁、戊及庚型肝炎病毒之后，日本学者Nishazawa新近发现的又一种肝炎相关病毒。献血员人群阳性率为12%，血友病患者检出率为46%，各型非甲—非戊肝病患者中的感染率在39%～52.5%之间[2～4]。国内最新研究显示密切的生活接触是其传播的另一重要因素[4]。一系列研究曾显示职业献血员及其该人群高度集聚地区HCV的感染率较正常人群显著为高[5]，但TTV感染状况的调查迄今尚未见报道。本研究对武汉地区一组既往职业献血员血清作TTV DNA检测，并与无献血史的义务献血员进行比较。两者分别为43.2%及5.6%，职业献血员高度集聚地区既往献血者的检测阳性率显著地高于自愿献血者人群。对上述人群同时做血清HCV RNA与HGV RNA检测，前者较义务献血组显著升高，推测系HCV主要经血液传播所致，后者阳性率较低，两组间未见显著差别。本组资料还显示血清TTV DNA阳性者HCV RNA检出阳性率高达77.8%，显著高于TTV阴性组的4.0%，病毒重叠感染者例数前者亦高于后者。结合本地区献血工作既往状况，以及作者早期对该地区献血员HBV及HCV感染的调查结果分析，我们有理由推测这一现象与管理不善的个体有偿献血有关。因而证实加大输血工作管理力度，推广以义务献血取代有偿献血的政策，对我国控制输血相关性疾病的传播是非常必要的。然而，尽管我国多数地区(包括武汉地区)有偿献血己经取消，但并不意味着由此造成的特定人群中TTV与HCV的区域性流行已经停止。在乡村不良卫生状况下TTV(同时包括HCV)将会通过密切的生活接触进一步传播，并可能在一定范围内造成流行。这一现象应该引起卫生管理部门的高度重视。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Nishizawa T.Okamoto H,Knishi K,et al.A novel DNA wnus(TTV)associated with elevated transfuminance levels in post-transfusion hepatitis of unknow etioiogy.Biochem Biophys Res Commun,1997；241：92
2，Okamoto H,Nishizawa T,Kato N,et al.Mclecular cloning and characterization of a novel DNA virus(TTV) associated with post-transfusion hepatitis of unknown euology.Hepatology research,1998，10：1
3，周伯平，马为民，孙彤，等.TTV在非甲-庚型肝炎患者中的检测、克隆及测序.中华传染病学杂志，1998；16：131
4，谭复明，骆抗先，王志明，等.输血后乙型和丙型肝炎毒性感染的前瞻性调查.中华肝脏病杂志，1997；5：42
5，李方和，黄元成，唐振亚，等.丙型肝炎病毒在供、受血者间传播的调查.同济医科大学学报，1997，16(3)：18
收稿1999-11-09
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